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RNA 修饰在调节各种生物过程中发挥关键作用，并与许多人类疾病有关。然而，通过测序直接鉴定 RNA 修饰仍然具有挑战性。纳米孔测序很有前景，但目前的策略因序列解码而变得复杂。酶切核苷单磷酸的序列纳米孔鉴定可以同时提供准确的序列和修饰信息。
2022年7月18日，南京大学黄硕团队在Nature Nanotechnology （IF=41）在线发表题为“Identification of nucleoside monophosphates and their epigenetic modifications using an engineered nanopore”的研究论文，该研究构建了一种超高分辨的工程化纳米孔（苯基硼酸修饰的异八聚体耻垢分枝杆菌孔蛋白 A 纳米孔），通过该纳米孔可以直接区分经典核苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、N7-甲基鸟苷、N1-甲基腺苷、肌苷、假尿苷和二氢尿苷的单磷酸盐，机器学习识别准确率高达99.6%。将该方法运用于天然RNA的表观遗传修饰鉴定，在免分离的RNA消化产物中实现了修饰核苷酸的直接定量分析，成功绘制胃肠癌标志物miRNA和酵母tRNA的修饰图谱。
总之，该研究方法适用于大量核苷酸、核苷酸修饰及核苷酸衍生物的检测，为快速定量分析天然RNA中的表观修饰提供高分辨单分子分析工具，并为发展边酶切边测序的纳米孔RNA表观遗传测序提供了重要的设计策略和研究方法。
另外，2022年5月26日，南京大学朱嘉教授及徐凝共同通讯在Nature Nanotechnology （IF=41）在线发表题为“High-yield solar-driven atmospheric water harvesting of metal-organic-framework-derived nanoporous carbon with fast-diffusion water channels”的研究论文，该研究报告了一种 MOF 衍生的纳米多孔碳，一种具有快速吸附动力学和优异光热性能的吸附剂，可用于高产大气集水 (AWH)。由于扩散阻力最小，优化的结构（40% 的吸附位点和~1.0 nm 的孔径）具有优异的吸附动力学。此外，碳质吸附剂通过高效的太阳能加热和高导热率表现出快速的解吸动力学。基于源自金属-有机框架的纳米多孔碳的快速循环集水器可以在单日光照下在 30% 的相对湿度下产生 0.18 L kgcarbon−1 h−1的水。所提出的设计策略有助于为先进的淡水发电系统开发高产、太阳能驱动的 AWH。
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许多 RNA 修饰是酶驱动的对核糖或核苷酸的核碱基的化学修饰。大约 170 种类型的 RNA 修饰是已知的，并且对于各种生物过程至关重要，例如遗传重新编码、前信使 RNA (mRNA) 剪接、mRNA 输出、RNA 折叠和染色质状态调节。越来越多的证据表明，大量的 RNA 修饰与癌症、神经系统疾病和其他人类疾病有关，因此可能被视为诊断标志物或治疗靶点。最近的报告还表明，RNA 修饰与谷物的产量有关。然而，准确定位不同的 RNA 修饰存在一个未满足但迫切的需求，而这由于它们化学结构的相似性而变得复杂。
RNA修饰的分析可以通过薄层色谱法、与紫外分光光度法结合的高效液相色谱法或与质谱法结合的高效液相色谱法进行。然而，它们都未能提供任何序列信息。基于下一代测序的方法允许绘制全转录组 RNA 修饰的图谱，但它们依赖于特定抗体或 RNA 的化学处理。这些方法通常只针对一种特定的修饰，因此只能通过测序检测到有限类型的修饰。这些包括假尿苷 (ψ)、N6-甲基腺苷 (m6A)、5-甲基胞苷 (m5C)、N1-甲基腺苷 (m1A)、N7-甲基鸟苷 (m7G)、5-羟甲基胞嘧啶、N6,2′-O-二甲基腺苷、N4-乙酰胞苷和 A-to-I 编辑。
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使用 PBA 修饰的 MspA 区分规范 NMP（图源自Nature Nanotechnology ）
第三代测序技术，包括由 Pacific Biosciences 或 Oxford Nanopore Technologies 开发的方法，可能会克服这些缺点。在 Pacific Biosciences 测序中，通过观察碱基掺入之间的时间变化来识别 RNA 修饰。另一方面，由 Oxford Nanopore Technologies 提供的纳米孔测序通过识别离子电流或事件停留时间的变化来报告 RNA 修饰。然而，纳米孔链测序策略仍然存在空间分辨率低的问题，当修饰的核苷酸是近邻时，情况更糟。
以exo-sequencing方式对 RNA 进行测序是一种不同的策略，通过该策略可以通过纳米孔顺序读取外切核酸酶分解的核苷酸。然而，这需要存在能够明确识别所有核苷酸及其主要修饰的高分辨率纳米孔。先前报道了嵌入环糊精的 α-溶血素 (α-HL) 来执行此任务，但结果未能显示出胞苷二磷酸和尿苷二磷酸之间的真正区别。RNA修饰的鉴定也没有得到证实。这种低分辨率应该是由 α-HL 的圆柱形管腔几何形状造成的。
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机器学习辅助 NMP 识别（图源自Nature Nanotechnology ）
相反，耻垢分枝杆菌孔蛋白A（MspA）是一种圆锥形的孔，广泛应用于纳米孔测序、单分子化学和生物大分子的结构分析中，更具优势。已知苯基硼酸 (PBA) 可与 1,2 或 1,3-二醇可逆地形成共价键。此前，将 PBA 引入纳米孔腔已成功应用于检测各种含顺式二醇的分析物，如糖类、肾上腺素和瑞德西韦。然而，以前没有报道过含有单个 PBA 接头的异八聚体 MspA 纳米孔，也从未报道过大量表观遗传修饰的单磷酸核苷 (NMP) 的纳米孔鉴定。
该研究构建了一种超高分辨的工程化纳米孔（苯基硼酸修饰的异八聚体耻垢分枝杆菌孔蛋白 A 纳米孔），通过该纳米孔可以直接区分经典核苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、N7-甲基鸟苷、N1-甲基腺苷、肌苷、假尿苷和二氢尿苷的单磷酸盐，机器学习识别准确率高达99.6%。将该方法运用于天然RNA的表观遗传修饰鉴定，在免分离的RNA消化产物中实现了修饰核苷酸的直接定量分析，成功绘制胃肠癌标志物miRNA和酵母tRNA的修饰图谱。
总之，该研究方法适用于大量核苷酸、核苷酸修饰及核苷酸衍生物的检测，为快速定量分析天然RNA中的表观修饰提供高分辨单分子分析工具，并为发展边酶切边测序的纳米孔RNA表观遗传测序提供了重要的设计策略和研究方法。
王玉琴、张善雨和贾文东为该论文共同第一作者，黄硕教授为论文通讯作者，陈洪渊院士对该工作做出了重要指导。研究受国家自然科学基金、江苏省高层次创业创新人才引进计划、江苏省自然科学基金、中国博士后科学基金等经费资助完成
参考消息：
https://www.nature.com/articles/s41565-022-01169-2
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