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导读
本文研究凉粉草多糖(MP)对环磷酰胺(CTX)诱导小鼠肝损伤的改善作用。本研究采用UPLC-Q-TOF/MS技术，以代谢组学方法为基础，探讨正常组、CTX诱导组和MP管理组大鼠肝组织和粪便中的代谢谱。肝脏和粪便样品的主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)得分图显示了正常、模型和高剂量MP组(MPH)之间的明显分离。肝脏中有18种内源性代谢物，粪便中有29种内源性代谢物，主要涉及8种代谢途径:牛磺酸和次牛磺酸代谢、苯丙氨酸代谢、α-亚麻酸代谢、三羧酸(TCA)循环、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、花生四烯酸代谢、鞘脂代谢以及色氨酸代谢。此外，我们在肝脏和粪便样本中观察到一种常见的代谢物花生四烯酸。这些内源性代谢物可能被认为是MP对肝脏保护的反应。这将有助于进一步了解MP的机制，并为进一步的研究提供基础。
亮点：
1. 凉粉草多糖具有保肝作用；
2. MP促进了粪便中SCFAs的产生；
3. 基于UPLC-Q-TOF/MS的肝脏和粪便代谢组学分析提供了一种评估MP治疗效果的策略；
4. 肝脏和粪便中的内源性生物标志物主要涉及8种代谢途径。
论文ID
原名：UPLC-Q-TOF/MS-based metabolomics reveals modulatory effects of Mesona chinensis Benth polysaccharide in liver injury mice induced by cyclophosphamide
译名：基于UPLC-Q-TOFMS的代谢组学研究凉粉草多糖对环磷酰胺致肝损伤小鼠的调节作用
期刊：Food Science and Human Wellness
IF：8.022
发表时间：2022.09
通讯作者：谢建华
通讯作者单位：南昌大学食品科学与技术国家重点实验室
实验设计
实验结果
1. MP对肝功能指标的影响
为了探究凉粉草多糖(MP)对环磷酰胺(CTX)所致小鼠肝功能的影响，本研究测定了小鼠肝脏中谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)的活性。与正常对照(NC)组比较，模型控制组(MC)的大鼠肝组织AST、ALT活性显著升高(P<0.05)。结果表明，CTX对小鼠肝脏有严重的损伤作用。与MC组比较，低剂量MP组(MPL)、中剂量MP组(MPM)和高剂量MP组(MPH)的 ALT活性均显著降低(P<0.05)。尤其是MPH组的AST、ALT活性与MC组比较差异有统计学意义(P<0.05)，说明MP高剂量组对CTX诱导的小鼠肝损伤有较好的改善作用。因此，我们选择MPH组进行后续的代谢组学研究。
图1 MP对环磷酰胺所致小鼠肝损伤的影响
(A)和(B)分别代表肝组织中AST和ALT的活性。同一列中不同字母(a-c)表示处理间的差异显著(P<005)。
2. MP对小鼠粪便中SCFAs的影响
未消化的多糖可被肠道微生物利用，而短链脂肪酸(SCFAs)是远端肠道发酵的肠道菌群所产生的天然多糖的主要代谢物，调节宿主的生理过程，在许多疾病的发生中起着重要作用。SCFAs主要包括乙酸、丙酸、丁酸和戊酸。与正常组相比，CTX处理组小鼠乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和总SCFAs浓度均显著降低(P < 0.05)(图2)，而MP灌胃后，上述4种总SCFAs浓度均明显升高，且呈剂量依赖关系，MPH组的SCFAs浓度恢复到NC组一致的浓度(P < 0.05)。这些结果进一步表明，MP有利于促进SCFAs的产生。
图2 粪便样本中总SCFAs、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸的浓度
当P < 0.05时，同一列中的不同字母(a-c)表示各处理组间的差异显著。
3.肝脏代谢组学分析
如图3A-B中PCA的3D得分图所示，在正离子(ESI+)和负离子(ESI−)模型中，QC样品分别紧密地聚集在得分图中。这表明该系统具有良好的稳定性和重复性，保证了实验的可靠性。随后，我们使用肝脏样本PCA得分图来区分NC组、MC组和MPH组之间的差异。PCA的3D得分图显示，三个组分别发生聚类，正离子和负离子模型的R2X分别为0.555和0.491，并且MC组具有偏离正常组的趋势，这表明内源性小分子代谢物发生改变。此外，MPH组与CTX治疗组在正离子模式下发生明显分离。之后，我们使用监督的OPLS-DA进一步区分两组分别在正离子和负离子模型中的代谢物谱差异。OPLS-DA模型的得分图如图3C-F所示，NC组可以明显地与MC组分开(ESI+: R2Y = 0.989，Q2 = 0.703；ESI−:R2Y = 0.980，Q2= 0.716)。类似地，MPH组可以明显地与MC组分开(ESI+: R2Y = 0.998，Q2= 0.961；ESI−:R2Y = 0.984，Q2= 0.820)。这说明OPLS-DA模型是可靠的，同时也提示小鼠肝脏代谢组学在NC组、CTX治疗组和MP治疗组具有明显的特征。此外，我们还进行了200次排列测试，以验证OPLS-DA模型是否过度拟合。模型的所有R2和Q2值都低于原始值，而Q2值接近于零，表明OPLS-DA模型没有显示过度拟合，并且获得的结果是高度可靠的。
图3 基于UPLC-Q-TOF/MS的多变量统计分析
(A)和(B)为无监督的主成分分析，分别以正离子和负离子模式绘制NC、MC和MPH组之间的PCA得分图；(C-F)为正交偏最小二乘判别分析，即三组之间的OPLS-DA得分图，(C)正离子模式下的NC组vs MC组；(D)正离子模式下的MC组vs MPH组；(E)负离子模式下的NC组vs MC组；(F)负离子模式下的MC组vs MPH组。
根据上述结果，我们选择潜变量作为生物标志物的依据是OPLS-DA模型中投影变量重要性(VIP)值大于1，单因素方差检验的P值小于0.05。结果显示，在肝脏样品中，NC组和MC组之间有12种不同的代谢物，并且我们在MC组和MPH组之间鉴定了13种不同的代谢物(表1)。由CTX诱导的肝损伤引起的差异代谢物的改变主要包括显著增加的溶血磷脂酰胆碱(LysoPC) (18:2)、LysoPC (20:4)、LysoPC (18:1)、LysoPE (18:0)、L-苯丙氨酸、溶血磷脂酰乙醇胺(PE) (18:1)、溶血磷酯酰肌醇(LysoPI) (18:0)、花生四烯酸、二高-γ-亚麻酸、油酸和16-羟基二十碳四烯酸(HETE)的水平，并显著降低十八酰胺的水平。然而，在MP的干预下，MC组和MPH组之间的不同代谢物为L-缬氨酸、二氢鞘氨醇、LysoPC (20:4)、LysoPE (18:0)、亚油酸酰胺、十八酰胺、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、二十二碳六烯酸、花生四烯酸、油酸。此外，LysoPC (20:4)、LysoPE (18:0)、十八酰胺、L-苯丙氨酸、花生四烯酸和油酸在NC组、MC组和MPH组中共同存在。所有这些改变的不同代谢物，LysoPE(18:0)在MC组中显著上调，而在MPH组中有效地下降到正常水平。
表1 小鼠肝脏样本中各组内源性代谢物的比较
↑，↓表示代谢物含量分别增加和减少。LysoPC：溶血磷脂酰胆碱，LysoPE：溶血磷脂酰乙醇胺；PE：磷脂酰乙醇胺；LysoPI：溶血磷脂酰肌醇。
4. 粪便代谢组学分析
粪便代谢组学的结果与肝脏的结果相似，证实了MP对CTX诱导的小鼠肝损伤的改善作用。首先，QC样本也明显聚集在一起，以验证系统的稳定性，如图4A-B所示。此外，粪便的PCA分析结果显示，三组分别在正离子和负离子模式下独立聚集(ESI+:R2X = 0.585；ESI−:R2X = 0.611)。同时，MC组与正常小鼠有显著差异，进一步说明CTX引起的内源性代谢物发生了显著变化，即模型建立成功。在MP干预后，MPH组接近NC组，这表明MP治疗改变了粪便对CTX暴露的代谢反应。为了揭示MP对小鼠的有益作用，我们使用OPLS-DA模型分析粪便样本数据。OPLS-DA模型的得分图如图4C-F所示，NC组、MC组和MPH组可以成对分离。类似地，NC组和MC组之间发生明显分离(ESI+: R2Y = 0.993，Q2= 0.934；ESI:R2Y = 0.992，Q2= 0.716)，并且MC组和MPH组之间发生明显分离(ESI+: R2Y = 0.985，Q2= 0.883；ESI:R2Y = 0.978，Q2= 0.883)。这些结果表明，CTX和MP可引起代谢变化。类似地，200个排列测试的结果发现，所有的OPLS-DA模型都没有过度拟合。
图4 基于UPLC-Q-TOF/MS对各组粪便进行多元统计分析
(A)和(B)为无监督主成分分析，并分别以正离子和负离子模式绘制NC、MC和MPH组之间的PCA得分图；(C-F)为正交偏最小二乘判别分析，即三组之间的OPLS-DA得分图，(C)正离子模式下的NC组vs MC组；(D)正离子模式下的MC组vs MPH组；(E)负离子模式下的NC组vs MC组；(F)负离子模式下的MC组vs MPH组。
之后，我们选择OPLS-DA模型中VIP > 1和P < 0.05的代谢物作为粪便潜在生物标志物进行鉴定。与NC组相比，MC组粪便样品中的21种内源性代谢物发生了显著改变，其中13种内源性代谢物上调，8种内源性代谢物下调(表2)。其中，MG (18:2)、亚油酸、油酸、油酰乙醇酰胺、棕榈酰乙醇酰胺、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、L-苹果酸、N-乙酰-L-谷氨酸、亮氨酸、苯乳酸、蓖麻油酸和花生四烯酸的水平显著增加。相反，鸟苷、鸟嘌呤、十八碳四烯酸、十八碳酰胺、脱氧鸟苷、癸二酸、α-亚麻酸和肌苷的水平显著降低。在MP干预后，19种内源性代谢物与MC组相比发生了显著变化，其中8种内源性代谢物上调，11种内源性代谢物下调(表2)。MP处理显著提高了马尿酸、柠檬酸、鸟苷、肌苷、肉桂酰甘氨酸、癸二酸、十二烷二酸和12,13-二羟基-9Z-十八碳烯酸(12,13-DiHOME)的水平，同时降低了亚油酸、油酸、亚麻酸、棕榈酰乙醇酰胺、牛磺胆酸、熊去氧胆酸、牛磺酸、N-乙酰神经氨酸、苯乳酸、蓖麻油酸和花生四烯酸的水平。此外，我们在所有三个处理组中都发现了亚油酸、油酸、油酰乙醇酰胺、棕榈酰乙醇酰胺、熊去氧胆酸、鸟苷、肌苷、苯乳酸、癸二酸、十二烷二酸和花生四烯酸。幸运的是，MP减轻了由CTX引起的代谢紊乱，并逆转了接近于NC组水平的亚油酸、油酸、熊去氧胆酸、苯乳酸、癸二酸、肌苷、鸟苷、蓖麻油酸和花生四烯酸的水平。
表2 小鼠粪便样本中各组间的内源性代谢物
↑、↓分别表示代谢物含量增加和减少。
5. 热图分析
我们对鉴定的数据进行聚类热图分析和相关性分析，以进一步了解不同处理组中小鼠的代谢差异(图5)。热图直接揭示了每个生物标志物的变化，表明NC组、MC组和MPH组之间相对值的增加或减少。
图5 肝脏(A)和粪便(B)中差异代谢物的热图
行:样品；列:生物标志物；(C)代表了肝脏和粪便中三组代谢物的相关性分析。红色代表向上调整，蓝色代表向下调整。
6. 生化解释和途径分析
为了识别和可视化在CTX引起的肝损伤中受MP影响的可能代谢途径，我们使用MetaboAnalyst 4.0进行代谢组学途径分析。在本研究中，我们通过途径拓扑分析将计算的影响值阈值设置为0.10，高于0.10的影响值阈值被认为是潜在的代谢途径。肝脏代谢结果显示，CTX和MP处理的干扰主要包括以下五条代谢途径：鞘脂代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、花生四烯酸代谢、苯丙氨酸代谢和色氨酸代谢(图6A)。图6B显示了CTX和MP对粪便代谢的影响，主要涉及六种代谢途径：牛磺酸和次牛磺酸代谢、苯丙氨酸代谢、α-亚麻酸代谢、柠檬酸循环[三羧酸(TCA)循环]、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成以及花生四烯酸代谢。其中苯丙氨酸代谢、花生四烯酸代谢和苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成共同参与肝脏和粪便的代谢。表3总结了重要代谢途径的信息，并相应地构建了代谢途径图7。结果表明，这些途径在CTX损伤小鼠中表现出明显的紊乱，可通过MP调节抑制肝损伤的发生。
图6 用MetaboAnalyst 4.0对肝脏(A)和粪便(B)进行途径分析的总结
表3 MetaboAnalyst 4.0的途径分析结果
Total表示途径中化合物的总数；Hits是来自用户上传数据的实际匹配数量；Raw P是富集分析计算的原始P值；Impact是通过途径分析计算的途径影响值。
图7 MP对CTX致小鼠肝损伤保护作用的相关代谢途径及关键生物标志物分析
与MC组相比，代谢物旁边的红色箭头和绿色箭头分别代表MP处理后代谢物的相对增加和相对减少。
肝脏是氨基酸代谢的重要器官，在维持氨基酸代谢平衡中具有不可替代的作用。此前有报道称，当肝脏受损时，促进蛋白质分解代谢的激素增加，失活减少，导致体循环中蛋白质分解代谢和一些氨基酸水平增加。在目前的研究中，肝脏代谢组学的结果显示，与对照组相比，肝损伤小鼠肝脏中苯丙氨酸的含量显著增加(P < 0.05)，表面肝脏发生了代谢紊乱。
AST和ALT是位于肝细胞中的两种重要酶，是肝脏损伤的指标。当肝细胞膜发生脂质过氧化时，这两种酶很容易被释放出来。本研究同时检测了肝脏中这两种重要的酶，发现CTX治疗确实显著提高了AST和ALT的活性(P < 0.05)，并且观察到了NC组和MC组之间的差异，表明肝损伤模型建立成功，这与以前的研究一致。连续7天灌胃MP可以减少AST和ALT的释放，从而减轻肝损伤。具体来说，200 mg/kg·bw的MP具有更好的保肝作用。
苯丙氨酸参与苯丙氨酸的代谢以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，表明苯丙氨酸的代谢受到CTX的严重影响。一方面，氨基酸代谢异常导致氨基酸代谢下降，并带来氨基酸水平的增加；另一方面，身体吸收氨基酸的能力降低。由于许多氨基酸在肝脏中被酶代谢，所以它们与肝脏酶的活性直接相关，这与上述肝脏中AST和ALT活性的结果一致。色氨酸是人体八种必需氨基酸之一，参与色氨酸代谢。然而，苯丙氨酸和色氨酸水平在MP处理后仍然升高，这种异常变化可能表明氨基酸代谢功能障碍。缬氨酸(一种重要的支链氨基酸)的水平在MP处理后显著降低(P < 0.05)。以上结果可以推测，MP可能通过调节支链氨基酸的代谢来改善CTX诱导的肝损伤。
大量报道证明，脂质代谢在炎症、肿瘤、血管内皮功能和酒精性肝损伤等人类生命系统的生理和病理生理中起着关键作用。甘油磷脂是人体中最丰富和复杂的磷脂类型之一，广泛存在于所有组织中。除了参与膜表面活性剂等物质的合成外，还参与胆汁合成、细胞信号转导和维持机体的代谢，从而保证机体的能量和各种代谢正常。因此，在组织代谢组学研究中，人们已经报道了许多干扰途径。磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰肌醇(PI)是主要的生物形式，而溶血磷脂酰胆碱(LysoPCs)是通过水解PC产生的。溶血磷脂酶是评估暴发性肝衰竭严重程度的良好标志物。一般来说，它们在细胞或组织中的含量都很低，浓度过高会对细胞的膜系统造成损伤，严重时会造成机体功能障碍。本研究结果表明，MC组肝脏中LysoPC (18:2)、LysoPC (20:4)、LysoPC (18:1)、LysoPE (18:0)、PE (18:1)和LysoPI (18:0)的含量显著增加(P < 0.05)，提示CTX治疗导致严重的甘油磷脂代谢紊乱。这些甘油磷脂的变化可以作为潜在的标记物。此外，MPH组小鼠肝脏中LysoPE (18:0)水平与MC组呈负相关，MP治疗显著逆转CTX诱导的异常变化，表明MP可能通过调节LysoPE (18:0)在一定程度上缓解甘油磷脂代谢障碍。
在这项研究中，我们还发现CTX诱导的肝损伤与花生四烯酸代谢密切相关。花生四烯酸代谢途径中的花生四烯酸，是HETEs等促炎代谢物的前体，可加速肝脏毒性的进展。以往的研究证明，当肝脏受损时，花生四烯酸被磷脂酶A2分解成游离形式并释放出来，然后一系列代谢酶产生多种活性物质。我们的数据始终显示，与对照组相比，CTX诱导的肝损伤组的肝脏和粪便中花生四烯酸水平显著升高。同时，MC组的炎症代谢物16-HETE在肝脏中也显著增加(P < 0.05)，表明花生四烯酸代谢失衡可能是CTX诱导肝损伤的标志。虽然MP处理没有降低肝脏中花生四烯酸的水平，但它能将粪便中的花生四烯酸恢复至正常水平(P < 0.05)，并抑制了代谢紊乱。此外，肝组织和粪便代谢组学中有相似的代谢物，表明MP处理可能影响肝和粪便之间的相互作用。肝脏与肠道关系最为密切，在肠道中，肝脏通过门静脉循环，保护不良的细菌成分和代谢物。
而且油酸和亚油酸可以代谢成花生四烯酸。本研究中，肝损伤组小鼠肝匀浆和粪便中油酸含量显著增加，粪便中亚油酸含量也显著增加。服用MP后，粪便中油酸和亚油酸的含量急剧下降(P < 0.05)，进一步表明MP能缓解花生四烯酸代谢异常。MP也介导鞘氨醇代谢。鞘氨醇是一种具有长不饱和烃链的氨基醇，是细胞膜的成分之一。其代谢异常与多种疾病密切相关，在调节细胞方面具有重要的生理功能。我们的结果表明MP可能通过调节鞘氨醇的含量来影响鞘氨醇的代谢。肝损伤小鼠的十八碳四烯酸和α-亚麻酸水平显著低于NC组，表明CTX严重干扰了α-亚麻酸的代谢。
苹果酸是TCA循环的中间代谢物。众所周知，TCA循环是糖类、脂肪和蛋白质三大物质代谢的重要枢纽，为哺乳动物提供能量来源。与对照组相比，MC组苹果酸显著增加(P < 0.05)，表明CTX可能显著干扰TCA循环。CTX损伤肝脏后，TCA的能量代谢减慢，人们在CCl4诱导的肝损伤小鼠中观察到同样的现象。柠檬酸合成是TCA循环的重要部分，与MC组相比，我们在MPH组中发现生物标志物柠檬酸的显著增加(P < 0.05)。以上研究可能为CTX和MP调节代谢物之间的关系提供了可能，MP对能量代谢的影响需要进一步的研究。
根据结构，胆汁酸可分为游离胆汁酸，如胆酸和脱氧胆酸，以及结合胆汁酸，包括上述结合甘氨酸和牛磺酸的游离胆汁酸。首先，胆汁酸的异常增加引起氧自由基和内质网应激的产生，最终诱导细胞凋亡，可作为肝损伤的生物标志物CTX引起鹅去氧胆酸和熊去氧胆酸的显著升高，而MP使熊去氧胆酸的升高恢复到正常水平(P < 0.05)。其次是牛磺胆酸水解生成牛磺酸，牛磺酸再被半胱氨酸脱羧生成taurosulfonic acid，taurosulfonic acid进一步氧化，参与牛磺酸和次牛磺酸代谢。牛磺胆酸含量升高可引起肝内的胆汁淤积，导致肝内胆汁酸代谢紊乱，进而引起肝毒性。MP对CTX的保肝作用可能是通过改善胆汁酸代谢紊乱而实现的。由于初级胆汁酸是肝细胞以胆固醇为原料直接合成的，并从肝脏分泌出来，进入肠腔。在一些酶和肠道微生物的作用下，初级胆汁酸变成次生胆汁酸。因此，MP对CTX的肝脏保护作用与肠道菌群密切相关。
马尿酸的水平反映了肝脏线粒体的功能障碍，其含量的降低是诱发毒性化合物的常见指标。应用MP后，我们可检测到粪便中马尿酸水平的明显升高，提示MP对肝损伤有保护作用。一方面，马尿酸参与苯丙氨酸代谢。另一方面，马尿酸是肠道微生物的共同代谢物，很大程度上与肠道微生物的活性有关。肠道微生物在许多营养物质的消化吸收和疾病的预防中起着重要的作用。SCFAs是肠道微生物发酵的主要产物，它们的混淆会导致多种疾病，如炎症、肝纤维化、代谢性疾病等的发生。肝损伤组小鼠血清SCFAs浓度明显低于正常对照组。MP治疗明显恢复到NC组水平。我们之前的研究也证明了MP可以对肠道菌群起到有益的作用。上述结果进一步证实了MP可以调节肠道微生物的活性，减轻CXT引起的肝损伤。
结论
综上所述，本研究结合生化指标和代谢组学方法来评价MP对CTX诱导小鼠肝损伤的影响。MP降低肝脏中AST和ALT的水平，200 mg/kg bw的剂量是最好的干预剂量。本研究建立了基于UPLC-Q-TOF/MS的肝脏和粪便代谢组学方法，在肝脏匀浆中发现了18个潜在的生物标志物，在粪便中发现了29个潜在是生物标志物。这些代谢物主要与8种代谢途径有关。此外，MP促进粪便中SCFAs的产生，这可能与肠道微生物的代谢有关。这些结果不仅表明MP可能通过调节内源性代谢物发挥保肝作用，而且为肝损伤的治疗提供了科学依据。
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2213453022001732
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