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“借助这一成果，RNA 科学家的研究等于有了‘眼’和‘手’，不仅能原位实时看到活细胞中的 RNA，还能实时地动态调控 RNA，这将极大推动该领域的发展。我们也在与专家探讨该技术的商业化途径，希望助力生物制造与精准医疗。”
1 月 3 日，华东理工大学特聘教授、生物反应器工程国家重点实验室副主任、该校光遗传学与合成生物学交叉学科研究中心主任杨弋团队的最新论文发表在 Nature Biotechnology，给 RNA 研究者打造“眼和手”，是他对于该成果的定义。
图 | 杨弋（来源：杨弋）
研究中，他和团队研发出一种光控 RNA 结合蛋白，该蛋白能和 RNA 上的特定序列结合，从而起到光敏“开关”的作用，只需对光进行调节即可改变 RNA 功能和代谢功能。
图 | 光控 RNA 结合蛋白（来源：杨弋）
相关论文题为《使用人造光开关 RNA 结合蛋白对 RNA 功能和代谢进行光遗传学控制》（Optogenetic control of RNA function and metabolism using engineered light-switchable RNA-binding proteins）[1]。
图 | 相关论文（来源：Nature Biotechnology）
论文第一作者为刘韧玫博士与杨菁博士，杨弋和其研究团队的陈显军博士担任共同通讯作者。
杨弋表示：“整个研究前后持续八年，我们有时开玩笑说是‘八年抗战’。八年过去了，陈显军早已博士毕业，并成长为国家级青年人才； 3 年前刘韧玫博士毕业，完成了博士后，现在是华东理工大学讲师，也成为了光荣的妈妈；而我也成了爷爷辈（刘韧玫女儿叫我爷爷）。现在回头看看，如果团队有更多资源的话，相信这个工作还能提前 3 年与大家见面。”
图 | 研究团队（来源：资料图）
解决 RNA 研究长期以来缺乏高时空分辨控制技术的关键方法学/技术难题
具体来说，该研究解决了 RNA 研究长期以来缺乏高时空分辨控制技术的关键方法学/技术难题。近些年，随着人类基因组信息的解析，人们发现只有 2% 的人类基因组编码蛋白质，更有约 98% 的基因组意义不明，甚至被认为是“垃圾” DNA。
后来人们发现，所谓的“垃圾”DNA 其实是个宝贝，它能产生大量非编码 RNA，几乎所有重要的细胞生命过程都有它的参与，诸多重大疾病的发生和发展，也和它紧密相连。与蛋白质相同的是，细胞内的 RNA 兼具复杂型高级结构与复杂型相互作用，呈现出特定时间和特定空间的分布，转录后修饰状态也各不相同，这让它能精确地执行多种复杂型生物学功能。
（来源：资料图）
相比蛋白质研究，对于细胞内的 RNA 时间分布和空间分布、以及功能性研究，显得有些落后。主要原因之一在于，多年来始终缺乏可在活细胞内对 RNA 分子做实时监测和精密控制的技术。要想深入研究 RNA 功能机制，就会面临这一“卡脖子”问题，如何解决该问题也成为全球 RNA 研究领域的前沿热点。
在活细胞 RNA 实时监测技术上，杨弋团队此前和该校分子工程学院教授朱麟勇课题组成立的交叉学科联合攻关团队，曾基于合成生物学以及化学生物学原理，发展出 Pepper 系列高性能荧光 RNA，可对动物细胞内不同种类的 RNA，实现无背景成像和特异性标记。
在活细胞 RNA 高时空分辨控制技术上，杨弋团队也和几支国际团队，围绕 RNA 的生成控制技术发展了系列光控转录调控系统，这些系统可让在时间和空间上，精密控制活细胞和活体 RNA 的生成与基因表达。
但是在完成转录后，活细胞 RNA 仍有一些代谢行为，这对发挥 RNA 的正常生物学功能也很关键。因此，发展活细胞 RNA 转录后的代谢精密控制技术，将极大促进人们对于 RNA 的复杂功能与调控机制的解析。
而该团队此次发展的 RNA 光遗传学技术，系统性解决了 RNA 代谢的控制难题，可对动物细胞 RNA 的代谢活动比如生成、剪接、运输、翻译、降解等，进行高时空分辨的精密控制。
（来源：资料图）
光遗传学：21 世纪生命科学领域最引人注目的革新之一
尽管光遗传学是最近几年才发展起来的前沿学科，但凭借独特的高时空分辨率、以及细胞类型特异性，它让人们对生命现象的控制程度达到前所未有的水平，使生物闭环研究进入微扰时代与单细胞水平。
在国际上，杨弋实验室较早开展了针对中心法则的光遗传学研究，2012 年就在 Nature Methods 上报道了一个简单高效的 LightOn 光控基因表达系统，首次实现了哺乳动物活体内基因表达，即 RNA 转录的光遗传学时间和空间精密定量控制[2]，这也是中国科学家首次在该著名原创方法学期刊发表的原创研究论文，Nature Methods 也在同期“The Author File”栏目撰文介绍了该团队发明 LightOn 系统的研究历程。
转录之后， 在 RNA 实现特定生物学功能之后，又该如何对 RNA 分子活动进行时间空间精密控制？这样的技术几乎是空白。
意识到这一点后， 虽然当时没有足够经费支持，但杨弋还是果断立项了该研究。
他回顾称，此次研究主要包含三大步骤：光控 RNA 结合蛋白的设计与筛选、光控 RNA 效应因子的设计与构建、以及光控 CRISPR 系统的设计与构建。
其中，第一个步骤是最重要的，也是最具挑战性的。在活细胞中，RNA 的代谢主要是由细胞中各类 RNA 结合蛋白来执行的。
然而，这些 RNA 结合蛋白的活性很难被调控，它们一旦合成便具有活性。因此，发展活性可控的 RNA 结合蛋白，将有望实现对活细胞 RNA 代谢的控制。光遗传学技术，是该团队首先想到的控制技术，它能让我们以前所未有的时间和空间精度来精密控制生命体的各类生命活动。
这样一来，研究目标就非常明确，即发展光控 RNA 结合蛋白，利用光来调控它的活性。此前，在利用合成生物学方法设计与构建光可控功能蛋白质分子方面，杨弋小组已积累了丰富经验，利用光诱导蛋白同源二聚激活蛋白质活性的创新设计理念，他们构建出一系列的光控 DNA 结合蛋白。
这些光控 DNA 结合蛋白，由光敏蛋白结构域与 DNA 识别结合结构域构成，光照可以引起它们与 DNA 的结合能力发生改变，进而调控它们与 DNA 的结合。因此，杨弋认为可基于类似原理去设计和构建光控 RNA 结合蛋白。
接下来的难点是如何选择合适的光敏结构域与 RNA 结合结构域，以及如何建立高效的筛选系统。
作为一种光敏结构域，Vivid 来源于粗糙脉孢菌，蓝光照射可让其结构发生显著变化，进而形成同源二聚体。关于它的光敏特性研究已经非常详尽，杨弋是第一个开发利用 Vivid 独特光敏性质的科学家， 此前已经基于它设计和构建了多种光可控功能蛋白质分子，所以此次研究一开始就选择 Vivid 作为光控 RNA 结合蛋白的光敏结构域。
在 RNA 结合结构域方面，为避免与哺乳动物细胞本身组分发生交叉反应，该团队利用生物信息学的方法，从数据库中筛选出大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中结构与功能已知的、并且是以二聚体形式特异性结合特定 RNA 的蛋白结构域。
最终他们把目光锁定在细菌的抗转录终止因子，一方面它可以满足上述要求，另一方面可以利用细菌的抗转录终止系统，去构建高效的筛选系统。而利用流式细胞仪，则可以高通量的方式，筛选出性质优良的光控 RNA 结合蛋白。
（来源：Nature Biotechnology）
在做好前面的基础工作后，杨弋很快就得到具有优良光诱导特性的光控RNA结合蛋白，并将其命名为 LicV。
第二步是光控 RNA 效应因子的设计与构建。LicV 本身只是一个光控 RNA 结合蛋白，光照可以引起它与 RNA 的结合能力发生改变，进而调控它与 RNA 的结合。
该团队设想，能否将它与一个 RNA 效应结合结构域融合，构建光控 RNA 效应因子，实现活细胞 RNA 代谢的光遗传学精密控制呢？
因此，杨弋等人陆续构建出光控 mRNA 翻译起始因子、光控 RNA 剪接因子、光控 RNA 定位因子和光控 RNA 降解因子。他们发现，这些光控 RNA 效应因子均具有非常优良的光响应特性，可实现前文所述的时空精密控制能力。
（来源：Nature Biotechnology）
第三步是光控 CRISPR 系统的设计与构建。该团队将基于 LicV 的 RNA 效应因子，与 CRISPR 系统结合在一起的初衷是想调控细胞内源 RNA 的代谢。但令他们惊喜的是，通过对嵌合 sgRNA 的设计，使其可以招募更多的效应因子，从而让系统表现出明显放大效应，比如表现出更高的激活效率。
（来源：Nature Biotechnology）
此外，由于只需对 sgRNA 进行简单改造，而不涉及对 Cas 蛋白的遗传操作，该系统也表现出非常好的普适性，可简单且高效地对不同物种来源、和不同类型的 CRISPR 系统进行光遗传学调控。
（来源：Nature Biotechnology）
杨弋总结称：“我们不仅发展了高性能的 RNA 光控结合蛋白， 还将其与 RNA 代谢相关因子融合，构建了各类光控 RNA 效应因子，还显示了这些工具在几乎所有 RNA 代谢过程中都能工作。”
期间涉及体系建立、工程优化与试错研究等工作，耗费了大量时间。在分工上，由杨弋和陈显军牵头策划，刘韧玫和杨菁两位博士完成具体实验。
刘韧玫于 2011 年进入杨弋团队，2013 年她和陈显军（当时是博士生）正式开始研究。由于思路比较新颖、技术路线设计合理，前期进展颇有效率，不到半年就获得高效的 LicV 光控 RNA 结合蛋白。
他们利用 LicV 在细菌中做了大量测试，结果显示 LicV 具有优秀的性能，但绝大部分数据并未体现在论文中。后来随着团队成员承担的课题越来越多，陈显军把精力主要放在用于活细胞 RNA 标记的荧光 RNA 课题（2019 年该团队发表了 Nature Biotechnology 封面论文， 报道了 Pepper 系列高性能荧光 RNA，首次可在动物细胞内追踪各类 RNA[3]；2021 年与合作者在 Nature Chemical Biology 发文解析了其结构[4]）。
（来源：Nature Biotechnology）
当时，刘韧玫已投身其他课题，这导致该工作在后续两三年内并未得到全速开展。
后来，刘韧玫在读博尾声怀孕生孩子，杨菁在这一时期接棒该课题，并负责部分 RNA 效应因子和 LA-CRISPR 系统的构建工作。之后，刘韧玫又回归这个课题的全时研究，与杨菁一起最终顺利完成研究，投稿也很顺利，一审三位审稿人均给予正面评价，其中一位还是杨弋在该研究领域上的竞争者。
实现治疗蛋白合成的定时、定位和定量精密控制，有望真正实现精准医疗
据介绍，该成果系原创方法学，可用于生物医学基础研究，有助于深入分析各类生物种类、生物过程中 RNA 的功能。
在产业技术上也有以下潜在应用场景：
1、合成生物学与生物制造。当前，国际合成生物学的主要方向是通过人工代谢途径的构建，去改变物质的流动方向，进而发展相关生物制造技术，比如生物化工产品和药物等代谢物等。此次技术可通过精密调控 RNA 的代谢，来控制基因回路，加强人工代谢途径与宿主细胞适配性，提升生物制造效率。
2、精准医疗。光遗传学工具在时间、剂量、速度与可逆性的精准控制上具有很强优势，可助力精准医疗。
举例来说，mRNA 疫苗的核心概念是将 mRNA 分子递送到人体细胞，使人体细胞通过表达抗原组分，去激活特异性免疫应答，从而达到预防免疫的目的。目前，mRNA 疫苗不仅可用于疾病预防，未来也可用于疾病治疗，很多医药公司已在此投入大量人力和财力。
然而，mRNA 编码的治疗蛋白，在人体细胞中的表达水平往往会对治疗效果产生较大影响，而当下的技术方法很容易产生治疗不足或治疗过当，主要原因在于缺乏可控性。相比之下，杨弋此次研发的基于 LicV 的 LA-CRISPR 系统，可做到治疗蛋白合成的定时、定位和定量精密控制，有望真正实现精准医疗。
另一方面，上述系统还有望降低传统 CRISPR 系统的脱靶效应，使其更加安全。在利用传统的 CRISPR 系统进行基因治疗时，完成基因编辑工作后的 Cas 蛋白依然会在细胞中存在很长时间直至其被降解，这个时间持续得越长，脱靶效应可能就越明显。相比之下，LA-CRISPR 系统在细胞中的活性，可被精密控制的。
只有在光照条件下，CIRSPR 系统才具有活性；如果没有光照激活，即使 Cas 蛋白存在也不会发挥功能。因此，在实际应用中，可在 CRISPR 系统完成基因编辑工作后关闭光照，使得 CRISPR 系统迅速失活，从而降低脱靶效应，提高基因治疗的安全性。
（来源：资料图）
为生命科学提高系统的工具箱
对于后续计划，杨弋表示目前正开展的研究主要有：
其一是利用基于 LicV 的 RNA 效应因子，对 RNA 的表观遗传修饰以及 RNA 编辑进行精密控制；
其二是正在发展生物正交的 RNA 代谢光遗传学技术，这样就能同时对活细胞中多种 RNA 分子的代谢，进行时空精密控制，探究它们生物学功能的相关性；
其三是正在开展活体水平 RNA 代谢的光遗传学调控，包括建立活体 RNA 的研究方法、以及发展近红外光调控的 RNA 代谢光遗传学技术。
此外，团队还在继续开发生物正交的荧光 RNA 技术用于活细胞 RNA 示踪，希望荧光 RNA 也能像蛋白一样五彩缤纷与应用广泛。
图 | 杨弋（来源：杨弋）
杨弋是湖北人，1990 年从湖北黄冈中学考入清华大学并获得学士与博士学位，接着他先后先后在哈佛大学医学院、波士顿大学医学院、哈佛医学院及其附属的 Brigham & Women’s 医院工作，一直从事先进生物检测技术的研发。2006 年回国加入华东理工大学，开展细胞代谢监测与控制技术研发，至今已有 16 年。
对于未来他表示：“关于生命起源，著名的 RNA 世界假说认为 RNA 既有 DNA 功能与蛋白质功能，因而原始生命完全可以仅由RNA支撑。RNA 多才多艺，在生命中至关重要。我们实验室也在试图打造 RNA 研究的工具’世界’，RNA 代谢光遗传技术与荧光 RNA 技术一起可实现在单细胞与亚细胞水平，对 RNA 的代谢与功能进行闭环研究，为生命科学提高系统的工具箱。”
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参考：
1、Liu, R., Yang, J., Yao, J. et al. Optogenetic control of RNA function and metabolism using engineered light-switchable RNA-binding proteins. Nat Biotechnol (2022). https://doi.org/10.1038/s41587-021-01112-1
2、Wang, X., Chen, X., and Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat Methods 2012, 9, 266-269. https://doi.org/10.1038/nmeth.1892
3、Chen,X., Zhang, D., Su, N. et al. Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs, Nat Biotechnol, 2019, 37，1287-1273. https://doi.org/10.1038/s41587-019-0249-1
4、Huang, K., Chen, X., Li, C. et al. Structure-based investigation of fluorogenic Pepper aptamer. Nat Chem Biol 2021, 17, 1289-1295. https://doi.org/10.1038/s41589-021-00884-6
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