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作为我国新疆地区主要的经济作物之一，哈密瓜对当地经济发展起重要作用。由于新疆地域辽阔、交通运输不便，因此低温贮藏是使用广泛的果蔬保鲜方式之一。然而长时间的低温贮藏会导致哈密瓜发生冷害，加快哈密瓜表皮的凹陷、褐变以及腐烂，从而影响经济效益。因此从分子生物学角度研究哈密瓜的耐冷机制对提高哈密瓜耐冷性具有重要意义。
谷胱甘肽-S-转移酶（GST）是一种多功能酶，可以催化GSH和疏水及亲电底物的共价结合，形成共轭物，隔离在液泡或转移到质外体，从而对内源和外来有害物质进行降解，以达到降低细胞损害程度的作用。前期研究发现，与不耐冷型哈密瓜相比，耐冷型哈密瓜GST相关差异蛋白在冷胁迫初期显著上调表达。石河子大学食品学院，新疆特色果蔬贮藏加工教育部工程研究中心的宋 文、单春会*、唐凤仙*等人在生物信息学的基础上对哈密瓜DHAR基因（CmDHAR）进行鉴定分析，随后利用实时反转录聚合酶链式反应（real-time RT-PCR）技术分析冷胁迫下的基因表达情况，以期为进一步揭示DHAR基因在哈密瓜抵御冷胁迫过程中参与的反应机理奠定基础。等人
1、CmDHAR基因的基本信息
由表2可知，2个CmDHAR基因编码蛋白氨基酸的长度分别为CmDHAR1（297 aa）与CmDHAR2（206 aa），等电点分别为CmDHAR1（8.67）与CmDHAR2（5.99），分子质量分别为CmDHAR1（33 082.9 Da）与CmDHAR2（22 891.6 Da）。亚细胞定位结果表明，2个CmDHAR基因主要位于叶绿体中。染色体定位显示CmDHAR1位于哈密瓜6号染色体，CmDHAR2位于哈密瓜10号染色体。此外，CD-search结果表明，2个哈密瓜CmDHAR均包含可以结合GSH的GST-N末端功能结构域（CmDHAR1：1～297；CmDHAR2：3～203）。
2、CmDHAR系统进化与多序列比对分析
基于NJ构建的系统进化树显示，CmDHAR1与Q8LE52 AtDHAR2为直系同源基因；CmDHAR2与Q9FWR4 AtDHAR1为直系同源基因。结果表明，相比于OsDHAR，CmDHAR与AtDHAR之间的同源性更高（图1）。
图2表明，CmDHAR基因与AtDHAR和OsDHAR基因之间的氨基酸序列保守性较高，说明CmDHAR与AtDHAR和OsDHAR在抵御胁迫过程中具有类似的功能。此外，在CmDHAR的蛋白中还找到了12个GSH结合位点（G-site）与9 个磷酸化位点。
3、CmDHAR基因结构分析
由图3可知，CmDHAR基因包含6个外显子与6个保守基序，这与Q8LE52 AtDHAR2和水稻DHAR的基因结构相似，再次证明DHAR基因的高度保守性，说明它们在功能上具有一定的相似性。除了CmDHAR2，其他DHAR均包含motif 5，表明在进化过程中CmDHAR2缺失了这段氨基酸序列，也说明CmDHAR在进化过程中会存在一定的差异。
PlantCare预测结果表明CmDHAR基因包含10 种顺式作用元件（表3），它们可以分为3 大类：胁迫相关作用元件（WUN-motif、MBS与W box）、植物激素作用元件（TCA-element、TGA-element、TGACG-motif与CGTCA-motif）及光反应作用元件（GT1-motif、I-box与MRE）。
4、CmDHAR共线性分析
图4说明CmDHAR基因与其他葫芦科植物中的DHAR基因之间存在明显的共线性关系。哈密瓜与西瓜存在1 对同源基因对，与黄瓜存在2 对同源基因对，与西葫芦、笋瓜和南瓜之间各存在3 对同源基因对，说明在物种进化过程中，哈密瓜与西葫芦、笋瓜和南瓜更为接近。此外，CmDHAR2与其他5个物种至少存在1 对同源基因对，推测CmDHAR2在这6个物种分化前已经存在，也证明CmDHAR2在进化过程中十分重要。
非同义突变频率（K a ）与同义突变频率（K s ）的比值结果表明，8 对同源基因对的K a /K s ＜1，说明它们在进化过程中发生了纯化选择，避免了对自身不利的变异（表4）。基因倍增时间估算结果表明，这8 对同源基因对倍增的时间大约发生在0.65～3.5百万年前。
5、CmDHAR的蛋白互作分析
蛋白-蛋白网络互作分析结果表明（图5），CmDHAR成员与其他哈密瓜GST成员之间相互作用效果明显。因此推测，在响应胁迫过程中，DHAR可以有效调节其他家族蛋白共同发挥作用，参与一系列生化反应帮助哈密瓜抵御胁迫。CmDHAR与其他哈密瓜GST家族蛋白的具体互作机制将在日后进行深入研究。
6、CmDHAR三级模型的预测
图6表明，CmDHAR2蛋白主要由α-螺旋（紫色）、无规卷曲（白色）、延伸链（黄色）和β-转角（青色）构成。在CmDHAR2蛋白中找到了12个GST-N末端功能结构域的GSH结合位点（G-site），包括20C、22F、25R、44L、47K、58G、59K、60V、61P、72D、73S与202K。其中，20C、22F、25R、72D和73S 位于α-螺旋；58G、59K 与202K位于无规卷曲；60V与61P 位于延伸链；44L与47K位于β-转角。22F参与疏水互作；25R、60V、61P、72D与73S构成氢键；47K构成盐桥。这12个G-sites均位于CmDHAR2蛋白的表面，有利于CmDHAR2与GSH的结合。
7、CmDHAR基因响应冷胁迫的表达分析
由图7可知，低温贮藏对GE的影响更大。在冷藏第12天时，GE表皮开始出现褐变并产生凹陷，随着贮藏时间的延长，GE的冷害程度越来越严重。相比于GE，JS在第18天表皮开始产生凹陷，受冷害影响的程度较小。由此可知，在响应低温胁迫时，JS与GE内部抵御氧化胁迫体系的差异性决定了它们在贮藏过程中品质变化的差异性。
从图8可以看出，随着贮藏时间的延长，耐冷型JS和不耐冷型GE果实中CmDHAR活力呈现先上升后下降的趋势。在0～12 d，JS中的CmDHAR活力均高于GE，且在第12天时差异极显著（P＜0.01），随后酶活力逐渐降低。在GE中，CmDHAR活力在第18天达到最高值，随后活力下降（图8）。AsA含量随贮藏时间延长逐渐降低，但其在JS中的含量高于GE，说明在响应低温胁迫过程中，AsA扮演着重要角色。
利用real-time RT-PCR验证哈密瓜CmDHAR1与CmDHAR2基因在冷胁迫下的表达情况（图9）。随着贮藏时间的延长，CmDHAR1和CmDHAR2均为上调表达。与GE相比，CmDHAR1与CmDHAR2在JS中的相对表达量更高，说明CmDHAR基因在响应冷胁迫过程中的重要性，它的大量表达可以延缓冷害发生。
8、CmDHAR GSEA
基于基因表达结果，使用GSEA对CmDHAR进行功能注释，结果表明CmDHAR的高表达与结构分子活性、大分子复合物、细胞膜封闭内腔以及抗氧化活性等生物学功能显著关联（图10）。GSEA结果说明在冷胁迫下，CmDHAR可以通过参与上述生物学过程调节生化反应，从而响应冷胁迫。
结论
结果表明，2个CmDHAR编码蛋白氨基酸的长度分别为297 aa与206 aa，等电点分别为8.67与5.99，分子质量为33 082.9 Da与22 891.6 Da。多序列比对结果表明CmDHAR基因具有保守性较高的谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）-N端功能结构域。基因结构分析结果表明CmDHAR包含6个外显子、6个保守基序、3 类顺式作用元件。共线性分析表明哈密瓜与西葫芦、笋瓜和南瓜在物种进化过程中更为接近。蛋白质三级结构预测CmDHAR2主要包含α-螺旋、无规卷曲、延伸链和β-转角等。蛋白互作分析表明CmDHAR家族蛋白与哈密瓜其他GST家族蛋白之间联系紧密。冷胁迫下耐冷型哈密瓜“伽师瓜-310”中的AsA含量、DHAR活力及CmDHAR基因表达量明显高于不耐冷型的“金皇后-308”。GSEA结果表明CmDHAR基因参与结构分子活性、大分子复合物、细胞膜封闭内腔以及抗氧化活性等生物过程。本研究阐明了CmDHAR的生物信息学特点，证明了DHAR基因在哈密瓜抵御冷胁迫过程中的重要性。
本文《哈密瓜脱氢抗坏血酸还原酶基因的鉴定及冷胁迫表达分析》来源于《食品科学》2022年43卷2期117-125页，作者：宋文，张琴，宁明，周发科，杨新泉，单春会，唐凤仙。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20201109-084。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅
图片来源于文章原文及摄图网。
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