中国药科大学考研，中国药科大学考研难度
摘 要：目的 运用数据挖掘技术探明四妙丸类方临床应用配伍规律。方法 以中国知网、万方和维普为检索数据库，分别以“四妙丸”“四妙汤”“四妙方”为主题、篇关摘和关键词进行检索四妙丸类方的临床应用相关文献，运用Excel 2019、IBM SPSS Modeler 18.0和IBM SPSS 25.0软件进行频数分析和聚类分析，借助Cytoscape 3.8.2软件构建加味中药中最高频药物的成分-交集靶点-通路图。结果 共筛选到220篇文献，包含44种病名、72种主治症状和30种配伍比例；245首方剂涉及240味加味中药，共1783频次，以土茯苓为首的高频药物33味，加味中药按功效分类可分为18种，药味共373频次，药性共239频次，归经共590频次；关联规则分析得到14组关联规则，高频中药聚类分析得到7个聚类方。共收集四妙丸活性成分42个，土茯苓活性成分15个，筛选四妙丸-急性痛风性关节炎交集靶点31个，通路29条，四妙丸-土茯苓-急性痛风性关节炎交集靶点26个，通路38条。结论 频数分析和聚类分析等数据挖掘技术有助于对四妙丸类方的临床应用配伍规律进行总结，为指导四妙丸类方临床合理应用提供依据，并为研发相关创新药物提供数据参考。
四妙丸出自清代张秉承所著的《成方便读》，由黄柏、苍术、牛膝和薏苡仁4味药组成，是在元代朱丹溪的《丹溪心法》二妙散的基础上，增加牛膝和薏苡仁2味，水泛为丸，化裁而成。原方有云：“以邪之所凑，其气必虚，若肝肾不虚湿热决不流入筋骨。牛膝补肝肾强筋骨，领苍术黄柏，入下焦而祛湿热也，再加苡仁，……苡仁独入阳明，去湿热而利筋络，故四味合用之，为治痿之妙药也”[1]。四妙丸具有清热利湿之功效，广泛用于湿热下注所致之痹病，症见足膝红肿、筋骨疼痛等。新近报道，四妙丸可调和肾脏之阴阳失衡，蒸化、开阖、推动肾气以升清降浊[2]。现代临床应用该方多以四妙丸类方如与中药加味、联合化学药等形式，治疗湿热下注所致的多种疾病，如痛风性关节炎、膝骨性关节炎、高尿酸血症、肾病以及慢性盆腔炎等，其药理机制可能与抗炎、镇痛、抗氧化、促尿酸排泄等相关[3]。尽管四妙丸临床应用报道较多，但至今其临床用药规律却知之甚少。本研究拟利用数据挖掘技术对四妙丸类方临床主治疾病、加味中药用药规律等进行系统分析，以期为四妙丸类方的现代临床应用及衍生产品研发提供参考。
1资料与方法
1.1数据来源
以中国期刊全文数据库（CNKI）、万方数据库（Wanfang）和中文科技期刊全文数据库（VIP）为搜索数据库，分别以“四妙丸”“四妙散”“四妙汤”和“四妙方”为主题、篇关摘和关键词进行检索，检索年限为2010年1月1日至2021年9月1日。
1.2处方筛选
1.2.1纳入标准 临床用药案例和名医经验；有明确的药方记载，且除使用的中成药外，其他组方必须要有明确的剂量。
1.2.2排除标准 细胞实验、动物实验等基础研究；中药质量控制研究；与化学药联合应用；与四妙勇安汤有关；发表在不同期刊上的重复性研究等。
1.3数据处理
1.3.1建立数据库 将文献中的中药处方录入Excel 2019中建立数据库，将符合标准的文献进行数据提取，对文献名称、药物剂量、主治疾病、主要病名、加味中药等内容进行整理。
1.3.2中药标准化 以《中国药典》2020年版[4]的中药命名为标准，对涉及的中药药名进行统一，如将“银花”统一为金银花，“丹皮”统一为牡丹皮，“生地”统一为生地黄，“灵仙”统一为威灵仙。将不同炮制品且药物功效发生变化的归为不同药物，如将“甘草”和“炙甘草”划分为不同药物，并统计药性、药味和归经，若一味中药有多种药性、药味及归经，则全部记录在内。
1.3.3数据分析 采用IBM SPSSModeler18.0和IBM SPSS 25.0统计软件进行关联规则分析和聚类分析，并绘制网络关系图和聚类树状图，关联规则是反映一个事物与其他事物之间的相互依存性，支持度反映了2种药同时出现的概率，置信度反映了一种药出现后另一种药出现的概率，提升度反映了一种药物的出现对另一种药物的出现概率产生的变化，因此提升度大于1才有意义，关联规则说明了药物之间的关联性。聚类分析是将数据分类到不同的类或者簇的过程，同一个簇中的对象有很大的相似性，而不同簇间的对象有很大的相异性，因此聚类分析说明了几种药物之间的共性。
1.4活性成分-靶点-信号通路网络构建
在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://lsp.nwsuaf.edu.cn/ tcmsp.php）中查找四妙丸中的4味药及加味中药中高频药物所含的全部活性成分，通过评价成分的体内过程，用口服生物利用度（oralbioavailability，OB）≥30%和类药性（drug like，DL）≥0.18 筛选中药的活性成分[5]。在TCMSP中收集成分对应的靶蛋白，并通过Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）查询靶蛋白所对应的基因，进行归纳整理[6-7]。在OMIM（http://www.omim.org/）、Genecard（https://www. genecards.org/）和Drugbank（https://go.drugbank. com/）数据库采集四妙丸临床治疗的疾病中频次最高的病名所对应的靶点。利用STRING数据库（https://string-db.org/）构建交集靶点的蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，生物种属选择“homo sapiens”，将最低相互作用阈值设置为“medium confidence”（＞0.400），其他参数的设置保持默认。通过DAVID 6.8数据平台（https://david.ncifcrf.gov/）进行信号通路富集分析，并利用Cytoscape 3.8.2软件绘制最高频药物的成分-靶点图。
2结果
2.1文献纳入情况
根据纳排标准进行筛选，本研究共纳入220篇文献，均为四妙丸类方在临床上治疗相关疾病的研究，有6篇文献使用中成药，其余文献中筛选出中药组方共计251首，其中使用加味中药的组方共有245首。
2.2四妙丸基本方配伍比例分析
220篇文献中涉及到四妙丸类方的配伍比例共30种242个（除去使用中成药和四妙丸减味的组方），其中基本方中黄柏∶苍术∶牛膝∶薏苡仁占比较高的4种配伍比例为1∶1∶1∶2（60次，24.8%）、1∶1∶2∶3（35次，14.5%）、1∶1∶1∶1（32次，13.2%）、1∶1∶1∶3（26次，10.7%），其中四妙丸来源典籍《成方便读》中黄柏∶苍术∶牛膝∶薏苡仁的配伍比例为1∶1∶1∶1，具体见表1。
2.3四妙丸加味方主治病名频数分析
对220篇文献中涉及的疾病名称进行整理，将文献中的痛风都统一为急性痛风性关节炎，按文献中病程描述和临床表现分为急性痛风性关节炎和慢性痛风性关节炎；将膝骨性关节炎统一为膝关节骨性关节炎，急性和慢性盆腔炎统一为盆腔炎，共得到44种病名，总频数为256，其中频数＞15的为高频病名有3种，见表2。在排名前3位的主治病名中，治疗急性痛风性关节炎的最常用配伍比例为1∶1∶1∶2，治疗膝关节骨性关节炎最常用配伍比例为1∶2∶2∶2，治疗慢性痛风性关节炎最常用比例为1∶2∶1∶3，见图1。
2.4加味中药使用频数分析
所纳入的245首含有加味中药的组方中共涉及加味中药240味，频数共1783次，四妙丸类方中高频使用的加味中药共有33味（频数≥15次），累计出现的频数为1097次，占比61.5%，其中高频中药主要有土茯苓（89次，5.0%）、甘草（84次，4.7%）、萆薢（57次，3.2%）、赤芍（56次，3.1%），见表3。
2.5四妙丸加味方主治证素频数分析
220 篇文献中共涉及69 种证素，包括关节红肿热痛、关节屈伸不利、苔黄腻、舌红、脉弦滑数、小便黄、口干、发热、口苦、膝关节僵硬疼痛肿胀、心烦、食少纳呆、大便秘结、腰膝酸痛、乏力、皮肤暗红色、大便黏腻、脘腹痞满、夜眠不佳、下腹疼痛、口中黏腻、带下异常、脉濡数、舌边有瘀斑 和头痛等症状，总频数为 995 次，频数统计见表 4 ，其中高频证素（频数≥ 15 次）有 15 个。
2.6加味中药功效频数分析
将245首方剂中涉及到的240味加味中药进行功效统计，发现共涉及18种功效，总频数1783次，其中功效频数占比前5位的是清热药（421次，23.6%）、补虚药（302次，16.9%）、祛风湿药（275次，15.4%）、利水渗湿药（270次，15.1%）、活血化瘀药（246次，13.8%），见图2。
2.7加味中药性味归经分布
参照《中国药典》2020年版，对四妙丸类方中的加味中药进行性味归经统计和分类。同一味中药的不同性味归经分别统计入内，将中药药性为微寒、微温者全部统计为寒、温。统计显示240味中药中，药味频数共计373次，药性频数共计239次，归经频数共计590次。在药味统计中，频数较高的是苦（125次，33.5%）和甘（106次，28.4%）；在药性统计中，频数较高的是寒（89次，37.2%）和温（76次，31.8%）；在归经的统计中频数较高的是肝经（137次，23.2%）和肺经（81次，13.7%），见图3。
2.8高频药物的关联规则和聚类分析
利用SPSS Modeler 18.0中的Apriori算法造模探讨245首四妙丸方剂中的加味中药的配伍规律，设置最低支持度5%、最低置信度60%、最大前项数2，提升度大于1等条件挖掘潜在的中药组合，共得到关联规则14组，见表5。同时构建33味高频药物的关联网络图，见图4，利用SPSS Statistics 25软件对33味高频中药进行聚类分析，以组间距离23为界，可以将高频药物分为7组，见图5，药物组合与主治疾病的搭配见图6。
2.9网络药理学分析
TCMSP数据库中检索组方药物苍术、黄柏、牛膝和薏苡仁，以及加味中药中最高频药物土茯苓的化学成分，以OB≥30%和DL≥0.18为筛选条件共得到82个成分，除去找不到对应靶蛋白的成分，最终共获得四妙丸有效成分42个，土茯苓有效成分15个，见表6、7。42个成分中共收集到四妙丸靶点133个，利用Cytoscape 3.8.2绘制四妙丸的成分-靶点图，基因靶点由内向外代表与成分的连接逐渐减少，其中最外圈的靶点只与1种四妙丸活性成分对应，而最内圈的靶点与20～30个活性成分对应，见图7。以主治病名频数统计中排名最高的病名“acute gouty arthritis”（急性痛风性关节炎，AGA）为关键词进行检索，共得到靶点341个，其中四妙丸-AGA的交集靶点有31个，见图8，四妙丸-土茯苓-AGA的交集靶点26个，见图9。将交集靶点导入数据库，构建PPI网络，见图10。DAVID数据库分别对31个和26个交集靶点进行信号通路分析，筛选P＜0.01的通路，得到四妙丸-AGA交集靶点通路29条，四妙丸-土茯苓-AGA交集靶点通路38条，见图11。
3讨论
四妙丸中以黄柏为君药，取其寒以胜热，苦以燥湿，且善除下焦之湿热；苍术苦温，健脾燥湿除痹，共为臣药；牛膝活血通经络，补肝肾、强筋骨，且引药直达下焦，为佐药；薏仁独入阳明，祛湿热而利筋络，诸药合用，共奏清热利湿，补肾强筋之功[8]。本研究显示，临床该方应用多辅以清热解毒、渗淡利湿、活血化瘀、祛风通络、益气健脾、补益肝肾之药，形成四妙丸类方，主治痛风性关节炎、膝骨性关节炎以及高尿酸血症等病，疗效显著，然其配伍规律及机制不清。
现代药理学研究表明，四妙丸具有抗炎、镇痛、抗氧化和促尿酸排泄等活性，如黄柏与苍术提取物能显著地降低高尿酸血症小鼠血清尿酸水平[9]；牛膝总皂苷能通过抑制急性痛风性关节炎大鼠NOD样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NALP3）炎性体装配和激活以及抑制炎性细胞因子的表达来发挥抗炎作用[10]，基于数据挖掘、网络药理学及分子对接的研究显示，四妙丸中黄柏、牛膝、苍术组合可能通过干预嘌呤代谢通路和神经活性配体受体相互作用信号通路[11]；蛋白激酶1（protein kinases，AKT1）、白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、活化蛋白-1（activator protein 1，JUN）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3，CASP3）可能是四妙丸治疗高尿酸血症的关键靶点，与四妙丸中小檗红碱、表小檗碱、豆甾醇等活性成分具有良好的结合活性[12]。
本研究通过文献检索，全面收集了四妙丸类方临床应用等相关研究报道，运用定性、定量分析方法初步确定了四妙丸类方临床适应证，其中急、慢性痛风性关节炎为高频适应证，土茯苓、甘草、萆薢、赤芍和威灵仙等为四妙丸类方高频组方药物。高频药物关联规则分析共得到药对组合14种，其中置信度最高的药对组合为土茯苓-忍冬藤-萆薢，说明在土茯苓出现的中药组方中忍冬藤和萆薢同时出现的概率最高，另外木瓜-秦艽-防己也经常作为组合药对在方剂中出现。根据高频药物关联强度网络图可以看出土茯苓-甘草、土茯苓-萆薢药对关联密切，土茯苓-甘草-萆薢和土茯苓-赤芍-甘草3味药组成的药对也有较强的关联。湿热为急性痛风性关节炎核心病机，热盛则痛，湿盛则肿，药对组合结果也进一步验证了清热利湿、消肿止痛的治法[13]。同时通过高频药物的聚类分析可得到包括除湿解毒、活血化瘀、益气补血、清热利湿、舒筋活络类等7类不同功效的药物组合（图5、6）。药物组合与主治疾病关联分析结果显示，7类药物组合可用于急性痛风性关节炎、慢性痛风性关节炎、膝骨性关节炎及高尿酸血症等病症治疗（图6），如急性痛风性关节炎宜急则治标，治法以清热利湿、消肿止痛为主[14]，根据临床表现可选择组合1＋2＋5＋7（如土茯苓、萆薢、延胡索、金银花、连翘等）；慢性痛风性关节炎以脾肾亏虚为本，湿热痰瘀为标，宜标本兼顾，以健脾补肾、清热泄浊、祛瘀涤痰等治法为主[15]，在四妙丸基础上可选择组合1＋3＋4＋6（如土茯苓、萆薢、川芎、黄芪、当归、杜仲等）；高尿酸血症在痛风发作前临床症状多不明显，患者以痰湿、湿热及气虚体质多见，属虚实夹杂之证[16]，临床常以健脾泄浊为基本治法；膝骨关节炎是一种严重影响中老年人生活质量的慢性退行性疾病，属中医“痹证”“痿证”范畴，该病在发作期及缓解期多见湿热痹阻、气滞血瘀及寒湿痹阻等证型[17]，四妙丸加入组合1＋7，发挥清热祛湿、通络止痛之功效，以治疗湿热痹阻型膝骨关节炎。
由四妙丸的成分-靶点图可以看出前列腺素内过氧化物合成酶1（prostaglandin-endoperoxide synthase1，PTGS1）、PTGS2是四妙丸中的活性成分最常作用的靶点，PTGS是前列腺素内过氧化物合酶，是前列腺素生物合成中的关键酶，PTGS有2种同工酶，即组成型PTGS1和诱导型PTGS2，可由特定的刺激事件调节，与炎症相关的前列腺素生物合成有关。研究表明，下调PTGS2表达可抑制成纤维化细胞样滑膜细胞的增殖来减轻类风湿性关节炎大鼠的关节肿胀[18]。对四妙丸和加味中药中使用频次最高的药物进行分析对比，通过四妙丸-AGA与四妙丸-土茯苓-AGA富集分析显示，四妙丸及加味中药土茯苓的生物活性成分是通过多种途径作用于多靶点治疗急性痛风性关节炎的，且增加一味中药后通路富集的结果更多，2种富集分析涉及多种共同的信号通路，如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路、缺氧诱导因子（hypoxia inducible factors-1，HIF-1）信号通路、Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路、破骨细胞分化等通路，而自然杀伤细胞介导的细胞毒性、血清素的突触和甲状腺激素信号通路是四妙丸-土茯苓-AGA通路富集中较具有代表性的，说明土茯苓可能在这几种通路中发挥作用，且由图11可知其中甲状腺激素信号通路较为重要。TNF在调节免疫功能的同时，过量可造成对组织的损伤，能与其他促炎性细胞因子导致骨和软骨的损伤，也能抑制各种生长因子对软骨细胞的促有丝分裂作用[19]。HIF-1α充当缺氧传感器来调节细胞反应以适应缺氧环境，同时作为转录因子，HIF-1α调节一系列涉及炎症、血管生成、线粒体功能的基因[20]。Toll样受体和NOD样受体都属于固有的免疫受体，在各种自身免疫性疾病中起重要的调节作用。甲状腺激素信号通路对于骨骼的发育和生长是必不可少的。同样在成人中，骨量维持受甲状腺激素的控制。临床研究证实未经治疗的甲状腺功能亢进症是继发性骨质疏松症并增加骨折风险，正常的甲状腺功能对于骨骼健康至关重要[21]。
现代医学认为，高尿酸血症是以痛风为基础的生化改变，血尿酸浓度过高，尿酸析出的晶体瘀积于骨关节、肾脏及皮下，导致组织病理学的改变，最终发展为痛风性关节炎、痛风肾及痛风石[22]，尿酸盐晶体可通过产生软骨降解酶和促炎细胞因子导致关节破坏，表明痛风性关节炎的发病涉及免疫调节、炎症反应等多重调控机制，因此化学药治疗痛风性关节炎多以非甾体抗炎药、别嘌呤醇、秋水仙碱等为主，尽管有明确的效果，但也存在药物固有的不良反应，特别是用药之后导致的白细胞计数降低、肝肾功能损害、消化道反应等，使部分患者在治疗过程中承受较大痛苦，部分患者因无法耐受而停药，导致病情反复[23]，而中药在改善临床症状及控制复发等方面往往有独特疗效，同时还可以避免尿酸控制过低而带来的潜在风险，但由于药效成分、药理机制及质控标准等问题，限制了临床应用和推广。因此，亟待开发出药效成分明确、机制清楚、质量可控的创新中药。针对经典名方的配伍规律及现代临床研究，寻找和发现新的药物组合、有效部（成分）组合，是创新中药研发的有效途径之一，如在安宫牛黄丸基础上开发形成的清开灵注射液等[24]；对苏合香丸进行处方精简和剂型改革，研制的冠心苏合香丸[25]；由四妙勇安汤研发的脉络宁制剂等已成为此类研发的典型代表[26]。
综上，本研究基于四妙丸及高频加味中药的配伍规律分析，旨在阐明组方药物的活性成分互作靶点及通路，并在此基础上研制新的有效部位（活性成分）复方制剂，以期为开发中医药特色明显、配伍科学合理、药效成分基本清楚、药理作用基本明确、安全可控的防治痛风及关节性疾病创新中药，提供参考依据。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：梁欣仪，梅志刚，闻晓东．基于数据挖掘的四妙丸类方临床应用配伍规律分析 [J]. 中草药, 2022, 53(2): 507-518 .
中国药科大学考研(中国药科大学考研难度)