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编译：微科盟草重木雪，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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导读
银杏是我国特有的珍稀树种，并且历史悠久的传统中药，作用于心肺经络，据报道对非小细胞肺癌有显著疗效。然而，人们对这种代谢效应背后的机制知之甚少。本研究 旨在鉴定银杏叶提取物可能对非小细胞肺癌(NSCLC)产生影响的活性成分及其代谢调控机制。本研究采用LC-MS/MS研究银杏叶提取物的化学成分；网络药理学用于鉴定在非小细胞肺癌治疗中可能有价值的活性成分；使用CCK-8和细胞凋亡测定法评估抗肿瘤活性；使用非靶向代谢组学、靶向代谢组学和蛋白质印迹 实验进一步探索了活性成分的代谢调节机制。银杏叶提取物的网络药理学和成分分析确定了四种显著影响非小细胞肺癌的银杏内酯 ；它们在A549细胞中具有抗增殖活性。代谢组学分析表明，银杏内酯对与单碳代谢相关的代谢途径具有显著的调节作用，如嘌呤代谢、谷胱甘肽代谢和蛋氨酸循环。进一步对单碳代谢进行靶向代谢组学分析发现，银杏内酯可能显著影响A549细胞中多种代谢物的含量，包括嘌呤、S-腺苷甲硫氨酸、S-腺苷酰高半胱氨酸和谷胱甘肽上调，腺苷、四氢叶酸和10-甲酰基-四氢叶酸显 著降低。然而，银杏内酯处理后二氢叶酸还原酶(DHFR)和亚甲基四氢叶酸脱氢酶(MTHFR)发生了改变。这项体外研究表明，银杏内酯可能通过靶向单碳代谢来抑制A549细胞的生长。本研究还表明，代谢组学结合网络药理学是鉴定中药 活性成分和代谢机制的有力工具。
论文ID
原名：Metabolomics and integrated network pharmacology analysis reveal that ginkgolides act as potential active anticancer components by regulating one-carbon metabolism
译名：代谢组学和综合网络药理学分析表明，银杏内酯可通过调控单碳代谢发挥潜在的抗癌活性成分作用
期刊：Journal of Ethnopharmacology
IF：5.4
发表时间：2022.08
通讯作者：再帕尔·阿不力孜 & 陈艳华
通讯作者单位：中央民族大学
实验设计
实验结果
1. 银杏提取物（GBE）化学成分及网络药理学分析
我们使 用LC-MS/MS研究GBE中的主要成分（图S1），共确定了44个成分，包括31种黄酮类化合物（包括山柰酚、儿茶素、槲皮素、金丝桃苷和芦丁），五种酯类（包括银杏内酯A (GA)、银杏内酯B (GB)、银杏内酯C (GC)、白果内酯(BB)和对羟基苯甲酸甲酯）和八种酸性化合物（包括水杨酸、原儿茶酸、香草酸、咖啡酸和奎尼酸），如表S4所示。经TCMSP数据库检索，银杏叶的主要成分有307种。在口服生物利用度（OB）≥30%、药物相似度（DL）≥0.18的条件下筛选出26种主要有效成分。11种化合物与GBE中检测到的一致，如图1A所示；GA、GC、GB的DL值最高，而BB的OB值 最高。
图1 （A）银杏叶主要有效成分OB≥30%，DL≥0.18。红色字体的化合物表示与银杏叶提取物分析中相同的化合物。(B) 银杏相关基因与非小细胞肺癌相关基因交叉的韦恩图。蓝色和红色代表与NSCLC相关的靶基因数量和银杏叶中有效成分。(C) 公共靶基因的通路富集分析。颜色深浅表示p值，横轴表示匹配基因的数量。(D)“银杏有效成分-靶基因-NSCLC”网络图。蓝色椭圆、红色菱形、黄色矩形和绿色六边形节点分别代表靶基因、疾病、有效成分和草药。图中的线条代表了靶点之间的相互作用，线条越多，它们可能发挥的作用就越大。红框表示与NSCLC基因最密切相关的前十种化合物。
使 用GeneCard数据库搜索，在Gifts≥45的条件下，我们共筛选出1249个NSCLC相关靶基因。如图1B所示，在银杏28种主要功能成分的277个药效靶点中，163个与NSCLC的靶基因相关。我们对公共靶基因进行了KEGG富集分析，确定了179条潜在的调控途径。具有最小p值的前20个路径如图1C所示。GBE对脂质代谢通路的影响最为显著，显著影响了与细胞生长、增殖、分化、凋亡等生理活动密切相关的MAPK和PI3K-Akt信号通路。我们最后构建了“药效成分-靶基因-疾病”的网络图，如图1D所示。与NSCLC相关基因相关性最高的前十种化合物中的三种是银杏内酯（GB、GA和BB）。GB和BB可能通过MAPK1、MAPK3等基因靶点调控NSCLC，GA可能通过UGT1A1调控NSCLC。综上所述，采用中药网络药理学的方法，我们推测GBE中的银杏内酯，包括BB、GA、GB和GC，是NSCLC的潜在治疗方法。
图2 不同药物对A549细胞活力的影响
（A）GBE；(B)银杏内酯注射液（GLs）；(C)四种银杏内酯；(D)270 μg/mL GBE和150 μg/mL GLs中四种银杏内酯的定量结果。结果表示为平均值± SD (n = 6)。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001与未处理的对照组相比。
2. GLs可抑制A549细胞的生长并诱导其凋亡
银杏内 酯注射液（GLs）是治疗急性脑梗塞和恢复期脑梗塞的常用中药。GLs中的主要成分是BB、GA、GB和GC，因此后续实验中使用了GLs。为了进一步验证网络药理学的结果，我们使用CCK-8检测来评价GBE和GLs是否对A549细胞有任何特定的细胞毒作用。如表S5-1所示，阳性对照紫杉醇（PTX）处理组的浓度被确定。如图2A和表S5-2所示，相对于未处理的对照，GBE在300 μg/mL的浓度下将A549细胞增殖 显著降低至48.8658%（p < 0.05）。GBE以剂量依赖性方式抑制A549细胞的活力，IC50值为270.07 μg/mL。相对于未处理的对照组（p < 0.05），GL在150 μg/mL的浓度下显著降低A549细胞增殖至49.709%，如图2B和表S5-3所示。因此，GLs以剂量依赖性方式抑制A549细胞的活力，IC50 值为146.95 μg/mL。如图2C和表S5-4所示，GA、GB、GC和BB分别将细胞增殖率降低至84.849%、76.406%、69.640%和75.265%，以100 μg/mL的浓度处理24小时后，与未处理的对照组相比，超过一半的细胞存活（p < 0.05）。
随 后，我们对GBE和GL中的GA、GB、GC和BB进行了定量分析，在MRM模式下使用LC-MS/MS对四种银杏内酯单体进行定量（表S2和图S2）。10 μg/mL GBE中BB、GA、GB和GC的浓度分别为1595.41 ng/mL、800.39 ng/mL、71.57 ng/mL和114.03 ng/mL。5 μg/mL GLs中BB、GA、GB和GC的浓度分别为2336.71 ng/mL、917.11 ng/mL、88.87 ng/mL和194.32 ng/mL。如图2D所示，270 μg/mL GBE中 BB、GA、GB和GC的浓度分别测量为43.08 μg/mL、21.61 μg/mL、1.93 μg/mL和3.08 μg/mL。150 μg/mL GLs中BB、GA、GB和GC的浓度分别为70.10 μg/mL、27.51 μg/mL、2.67 μg/mL和5.83 μg/mL。这些化合物剂量均低于100 μg/mL。GBE和GLs中银杏内酯单体的浓度相似，只是GLs中BB的浓度几乎是GBE中浓度的两倍。结果表明，银杏内酯是GBE中的主要抗癌物质，四种银杏内酯联合作用优于单用银杏内酯单体。
对于细胞凋亡测定，流式细胞术 结果显示，GLs以浓度依赖性方式显著增加A549细胞凋亡的百分比，如图3B所示。与对照组相比（图 3A），当用150 μg/mL 的GLs处理时，总凋亡细胞的百分比从（8.43 ± 0.98）% 增加到（17.09 ± 0.53）%。150 μg/mL GLs处理组中早期凋亡细胞的百分比从（7.55 ± 0.98）%增加到（13.93 ± 0.45）%。晚期凋亡细胞百分比由（0.88±0.05）%增加到（3.16±0.09）%。结果表明，GLs处理后，早期和晚期凋亡细胞的比率增加，其中早期凋亡细胞增加更显著（表S6）。
图3 (A)用10 μg/mL PTX（阳性对照）、100 μg/mL GLs、150 μg/mL GLs和300 μg/mL GLs处理的凋亡A549细胞百分比的流式细胞术结果。(B)细胞凋亡的统计结果。所有实验均在三个独立的测定中进行，数据以平均值±标准差表示。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 与未处理的对照组相比。
3. GLs处理A549细胞的非靶向代谢组学分析
内源性细胞代谢物受到药物的显 著影响；因此，细胞代谢组学的评估可用于推断GLs的代谢调节。图4A和B中的结果表明，在OPLS-DA评分图中，未处理的对照组、PTX处理的组和GLs处理的组可以通过LC-MS/MS在正离子模式和负离子模式下显著分离。
为了确定GL处理组和未处理对照组之间A549细胞中代谢物的差异，我们对两组进行了OPLS-DA分析，如图S3A和B所示。置换检验用于验证OPLS-DA模型，并表明所建立的判别模型（图S3C和D）稳定可靠。火山图（图S3E和F）用于帮助筛选差异代谢物。根据VIP>1、p值 <0.05、倍数变化2倍以上的标准，我们在正负离子模式下分别筛选出346个和180个差异离子。如表S7所示，我们在正离子和负离子模式下鉴定了55种差异代谢物，包括脂质、嘌呤和氨基酸。GLs处理前后差异代谢物的变化如图S4所示。与对照组相比，除磷脂酰胆碱（PCs）外，腺嘌呤和S-腺苷同型半胱氨酸（SAM）在GLs处理后最显著上调。热图分析（图4C）显示三组之间存在显著差异。GLs和PTX通过调节不同的代谢途径影响A549细胞的生长。
为了 分析GLs参与A549细胞的可能途径，我们将GLs组和对照组之间的差异代谢物导入Metaboanalyst 5.0（https://www.metaboanalyst.ca/faces/home.xhtml）进行代谢途径分析。如图4D和表S8所示，受这些代谢物影响的前五种途径是谷胱甘肽（GSH）代谢、鞘脂代谢、色氨酸代谢、甘油磷脂代谢和嘌呤代谢。匹配代谢物数量最多的代谢途径是嘌呤代谢、甘油磷脂代谢以及半胱氨酸和蛋氨酸代谢。这些途径可能对GLs对A549细胞的抑制作用至关重要。
结合KEGG数据库，我们构建了 A549细胞上GLs的代谢调控网络，如图4E所示。最有影响的代谢途径是GSH，一种由单碳代谢途径中的蛋氨酸循环形成的S-取代衍生物。GLs对氨基酸的代谢有显著影响。氨基酸生物合成核苷酸和某些必需物质是通过单碳代谢连接起来的。在代谢中，这些氨基酸可以生成含有一个碳原子的有机基团，进入FA和蛋氨酸循环，从而为生产精胺、亚精胺、腐胺、肾上腺素、胆酸和胆碱以及核苷提供了基础。嘌呤代谢途径中有六种改变的代谢物。嘌呤使用一碳单位载体，如FAs进行生物合成，并为细胞增殖提供核苷酸的主要来源。嘌呤代谢是细胞（特别是癌细胞）生长和增殖所必需的。因此，这些结果表明GLs对A549细胞的药效学作用与单碳代谢途径密切 相关。
图4 (A)和(B) A549细胞上GLs的多变量分析。三组正负离子模式的OPLS-DA得分图；(C)热图分析；对照组（绿色）：未处理的对照组；PTX（蓝色）：阳性对照组；GLs（红色）：GLs处理组。(D) A549细胞上GLs的代谢途径分析；(E) A549细胞上GLs的代谢调控网络。绿色：下调，橙色：上调；蓝色：未检测到。
4. GLs对A549细胞单碳代谢的靶向分析
为了进一 步研究GLs可能通过调节碳代谢途径对A549细胞产生抗肿瘤作用的假设，我们通过LC-MS/MS对包含21种代谢物的单碳代谢途径进行了靶向分析。离子色谱图如图S5所示。图S6展示了GL给药前后代谢物水平的变化；表S9总结了它们的变化。结合KEGG途径和文献调查，假设的单碳代谢中断如图5A所示。给予GLs后，蛋氨酸循环中SAM、S-腺苷酸高半胱氨酸(SAH)和蛋氨酸的水平显著上调，而腺苷（ADO）的量减少。对上游和下游代谢物比率变化的进一步分析表明，在用GLs处理后，SAH与ADO的比例增加了近30倍，如图5B所 示。
图5 (A)代谢途径网络图。蓝色填充：下调；红色填充：上调；灰色填充：未检测到。(B) GLs给药前后通路上相邻代谢物比例差异的比较。
由于腺苷高半胱 氨酸酶（AHCY）是唯一分解SAH的酶，我们推测GLs可能通过抑制甲硫氨酸途径中ACHY的活性而具有抗癌作用，导致SAM和SAH增加并阻止ADO的合成。随后胺类产物的生物合成减少，我们推测GLs下调胺类生物合成，导致SAM在蛋氨酸代谢途径中的利用减少。SAH的富集也引起GSH的上调，GSH响应活性氧(ROS)引起的氧化应激损伤，通过提高细胞免疫达到治疗LC的效果。在叶酸循环中，给予GLs后FA和5-甲基-四氢叶酸(5-MT)的水平略有增加。THF、5,10-亚甲基-THF (5,10-MTHF)和10-甲酰基-四氢叶酸(10-FT)的水平降低，表明GLs可能协同下调FA和5-MT转化为THF和5,10-MTHF的生物过程，从而减少10-FT的含量，导致胸腺嘧啶的含量降低，胸腺嘧啶是细胞生物合成的前体物质，最终抑制癌细胞的生长和增殖。进一步比较上游和下游代谢物的比率表明，FA/THF增加了一倍以上（图 4B），而5,10-MTHF/5-MT减少了两倍多。因此我们推测相关酶二氢叶酸还原酶（DHFR）可能被抑制，而GLs可能激活亚甲基四氢叶酸脱氢酶（MTHFR）。
我们然后进行蛋白质印迹分析以验证 上面推测的三种关键预测代谢酶。结果表明，经过150 μg/mL GLs处理后，A549细胞中的DHFR水平显著降低（p < 0.05），而MTHFR水平显著增加（p < 0.01）。并且它们具有一定的剂量依赖性。结果表明，GLs可以通过调节DHFR和MTHFR的表达来显著影响A549细胞的代谢（图6和表S10）。
图6 GLs处理24小时后，通过蛋白质印迹评估DHFR、MTHFR和AHCY的表达。
研究表 明，GA、GC、GB、BB四种银杏内酯是抑制A549细胞增殖的重要成分，这与网络药理学的推测是一致的。代谢组学结果进一步表明，主要由四种银杏内酯组成的上市中药注射剂GLs，主要通过调节二氢叶酸还原酶（DHFR）和亚甲基四氢叶酸脱氢酶（MTHFR）来影响单碳代谢，从而抑制非小细胞肺癌细胞的生长和诱导细胞凋亡。
非靶向代谢组学分析表明，GLs对磷脂代谢物的调节最为显著。PCs是膜和脂蛋白上的主要脂质成分，在活性氧的作用下最容易生成氧化的PC。GB对细胞内氧化应激具有药理作用。因此，给药后A549细胞中磷脂的上调可能与抗脂质过氧化功能有关。六种差异代谢物，如次黄嘌呤、黄嘌呤、黄嘌呤5′-磷酸、GMP、Ara-AMP和腺嘌呤，被映射到嘌呤代谢途径，表明GLs可能通过调节嘌呤代谢影响A549细胞。研究发现，ASCL1低表达的小细胞肺癌细胞中嘌呤核苷酸显著增加，伴随着嘌呤合成途径相关基因的显著上调。另一个最有影响的代谢途径被 发现是谷胱甘肽代谢。 GSH是蛋氨酸循 环途径的下游代谢产物，可参与 外源化合物的解毒以及内源性代谢的各个阶段。在癌症发展过程中，癌细胞需要产生大量的谷胱甘肽（GSH）来抵抗氧化应激造成的损伤。GB可以提高肝病小鼠血液中GSH的水平，因此可解释GLs能提高细胞抗氧化能力。
众所周知，嘌呤生物合成需要叶酸，为细胞提供核苷酸的来源，这对细胞尤其是癌细胞的生长和增殖至关重要。它们都与单碳代谢密切相关，其中氨基酸代谢产生含有单碳原子的有机基团，并被转移参与嘌呤和胸腺嘧啶的生物合成以及随后的甲基化反应，从而可维持氨基酸稳态及表观遗传和氧化还原平衡等。
靶向单碳代谢的代谢组学分析进 一步支持了GLs可以显著调节A549细胞单碳代谢的假设。对于蛋氨酸循环，SAM和SAH显著增加，而ADO在GLs处理后显著降低。SAH和SAM是蛋氨酸循环中甲基转移反应中必不可少的代谢物。由于SAH和SAM具有非常相似的结构，因此SAH对所有依赖于SAM的甲基转移酶都有很强的抑制作用，并且与SAM一样参与自噬的调节。一般认为，SAH一旦形成，应迅速分解，以避免转甲基化反应受到抑制。在高等生物中，AHCY是唯一分解SAH的酶；因此，抑制AHCY的酶活性可导致细胞内SAH的积累，从而抑制甲基转移反应。该研究发现，在用GLs处理后，SAH/ADO比率显著增加，增加了30倍以上，如图5B所示。然而，WB实验表明GLs处理后AHCY酶的表达水平没有显著变化。
在叶酸 循环中，FA和5-MT略有增加。THF、5,10-MTHF和10-FT水平略有下降。THF是体内FAs的基本形式。THF是FA二次还原的产物。它也被称为辅酶F。它在嘌呤和嘧啶核苷酸的合成中携带一个碳基，并参与甘氨酸转化为丝氨酸以及组氨酸的分解。甲氨蝶呤等抗癌药物通过抑制辅酶F的合成发挥作用，阻止癌细胞合成必要的DNA和蛋白质，从而杀死癌细胞。本研究发现GLs处理后FA/THF比值显著增加，这表明GLs可能抑制DHFR的活性。蛋白质印迹结果证实，在给予150 μg/mL GLs后，DHFR的表达显著下降。DHFR是FA途径中最关键的还原催化剂。FA被DHFR依次还原为DHF和THF。许多靶向DHFR的抗癌药物，包括培美曲塞、甲氨蝶呤和普拉曲沙，已被用于治疗结肠直肠癌、肺癌和乳腺癌等癌症。
此 外，5,10-MTHF/5-MT减少到不及以前水平的一半，这表明GLs可能会激活MTHFR的活性。用100 μg/mL GLs处理后MTHFR显著增加与蛋白质印迹结果一致，并且其增量具有剂量依赖性。MTHFR将5,10-MTHF转化为5-MTHF，其参与蛋氨酸循环和各种基因的DNA甲基化。此外，MTHFR也是SAM合成的关键酶，这可以解释为什么GLs后SAM和SAH显著增加。此外，网络药理学推导出它与MAPK相关。叶酸循环中的MTHFR可通过多种途径影响肺癌细胞的增殖和侵袭，包括与MAPK受体结合、调节JAK/STAT通路、参与肿瘤进展。
结论
本研究通过结合网络药理学和代谢 组学方法，发现GBE中的GLs可以抑制NSCLC细胞的增殖。GLs对嘌呤代谢、谷胱甘肽代谢和蛋氨酸循环等与单碳代谢相关的代谢途径具有显著的调节作用。单碳代谢的靶向研究和WB实验表明，GLs可能通过调节DHFR和MTHFR，显著影响A549 LC细胞中多种代谢物的含量，尤其是单碳代谢途径中的嘌呤、谷胱甘肽、四氢叶酸和腺苷，抑制A549 LC细胞的增殖。
本研究仅以一种肺腺癌细胞系A549 NSCLC作为研究对象。下一步，我们将在更多的LC细胞系上进行验证和体内研究，进一步验证GLs对LC的作用机制。
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35952968/
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